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应用文献--用分泌型萤光素酶报告系统比较TTR启动子与CMV启动子的体内外表达特性

已下载1378次 / 原平皓生物
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简介:

GLuc ( Gaussia Luciferase) 是一种高灵敏度分泌型萤光素酶。本研究利用GLuc 的易分泌、高灵敏性和检测方法简单快速的特点,初步比较了TTR 启动子( PTTR) 与CMV 启动子( PCMV ) 的体内外表达特性。首先构建了两种启动子2报告基因表达质粒pAAV22neo2TTR2GLuc 和pAAV22neo2CMV2GLuc。用脂质体转染法将它们分别转染至两株肝细胞源的细胞株Huh7 与Hep G2 以及两株非肝细胞源细胞株HEK293 与HeLaS3 。在转染后不同时间点取细胞培养上清液检测GLuc 的表达。此外采用水动力注射法,将这两种质粒分别以注射剂量0. 1μg、1μg 和10μg/ 只经尾静脉注射至BALB/ c 小鼠体内,注射后2h 开始在不同时间点上经尾静脉采集全血(2. 5μl/ 次) 并测定血液中的GLuc 水平。细胞实验结果显示,PCMV 介导的GLuc 表达都明显高于PTTR ;然而,在HEK293 和HeLaS3细胞中PCMV比PTTR的表达水平高50~300 倍,而在Huh7 和Hep G2 中仅高10 倍以内,提示PTTR具有相对的肝细胞特异性。在小鼠实验中,PCMV介导的GLuc 表达在各剂量组中也明显高于PTTR ,然而它们表达水平变化特征明显不同: PCMV介导的GLuc 表达在质粒注射后约10h 达到大值,此后迅速下降;而PTTR介导的GLuc 表达在质粒注射后约48h 达到峰值,随后缓慢下降。上述实验结果提示,PTTR虽然在表达强度方面不及PCMV ,但其介导的表达水平维持长时间,下降较缓慢,比较适于目的基因在肝脏内的较长时间表达。