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以4-MU(四甲基伞形酮)为底物定量测定GUS基因活性和ß-半乳糖苷酶(Gal)活性在TBS-380微型荧光计上的应用

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简介:

Gus基因存在于E.coli等一些细菌基因组内,编码β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)。β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶,能够水解β-葡萄糖醛酸苷的带有光学活性基因的衍生物,以4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷(4-methyklumbelliferone-D-glucuronide,4-MUG)为底物,产生的4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone,4-MUB)具有荧光,其检测灵敏度达fmol级。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性,因此这个基因被广泛应用于植物基因调控的研究中。
GUS基因作为报告基因的优势:
1. GUS蛋白在植物细胞中稳定存在,对较高的温度和去污剂有一定的耐受性;
2. 检测方法简单,可定性或定量:使用X-Gal为底物,通过显色反应来观察;
3. 使用4-MU为底物,反应以后生成荧光物质,通过相应的荧光检测仪来进行经确定量;
4. 多数植物组织中GUS背景表达低,样品表达能够很好区分。

ß-半乳糖苷酶(Gal)的基因可以用来研究启动子的功能、组织特异性表达、发育调控、mRNA的稳定性以及各种细胞器靶向蛋白的信号序列。应用ß-Gal来测定启动子和基因的活性具有双重优点;检测方法简单,用于酶活性分析的底物容易获得,使用TBS-380微型荧光计对溶液中ß-Gal活性进行检测时,其灵敏度和定量与荧光基质底物4-MU(四甲基伞形酮)相关。