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分泌型碱性磷酸酶(SEAP)发光检测

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简介:

        分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phos-phatase,SEAP)是人胎盘碱性磷酸酶的突变体,最大特点是能由表达细胞分泌到细胞外,检测时可在不破坏细胞的情况下,任意时间点取细胞培养上清液进行重复、动态的检测,且被检测细胞还可继续其他用途。使用发光检测方法可以进一步提高SEAP的检测灵敏度。

原理:

检测方法:

以CLONTECH的Great EscAPe™ SEAP检测试剂盒为例

1. 试剂准备
a) 发光增强剂:将发光增强剂与buffer按比例混合(95ul+100ul每个样品),使用前平衡到室温
b) 稀释buffer:使用去离子水将5X Dilution buffer稀释为1Xbuffer
c) 化学发光底物:25mM的化学发光底物与发光增强剂以1:19的比例混合,避光保存
d) 阳性样品:在23ul空细胞的培养上清中,加入2ul的SEAP样品

2. 样品处理
a) 取25ul细胞培养上清,加入1.5ml离心管中
b) 加入75ul的1X Dilution buffer,混匀
c) 65℃热处理30min后,降温到室温
d) 加入100ul发光底物,室温下孵育30min

3. 检测结果
孵育结束后,放入发光检测仪检测发光值。

参考文献:

  1. Berger, J., Hauber, J., Hauber, R., Geiger, R. & Cullen, B. R. (1988) Secreted placental alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells. Gene 66:1–10.
  2. Cullen, B. R. & Malim, M. H. (1992) Secreted placental alkaline phosphatase as a eukaryotic reporter gene. Meth. Enzymol. 216:362–368.
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