发光检测

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双荧光素酶报告基因发光检测

阅17529次 / 原平皓生物

简介:

        双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞,带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关,偶联到组成型启动子的第二个报告基因,提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别, 细胞转染和裂解的效率。
        此前使用萤火虫荧光素酶,可以结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)作为双报告基因。但CAT、β-Gal等的检测方式复杂,且灵敏度和可检测范围较差,作为内参不是很理想。

而使用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶作为双报告基因有多种好处:
  1.  萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶反应都为发光反应,检测方式一致
  2.  两种反应检测灵敏度与检测范围近似,可以检测到更小的量和更大的范围
  3.  两种发光反应底物不同,不会相互影响
  4.  通过方法将两个检测串联起来,实现同一样品,两步检测,得到两个检测结果。

原理:

检测方法:

以Promega公司双荧光素酶检测试剂盒为例:

1. 试剂准备
按照说明书配制PLB细胞裂解液、LAR II检测液、Stop&Glo检测液。

2. 样品准备
按照说明书使用PLB细胞裂解液裂解细胞,取20ul细胞裂解液

3. 检测过程
a) 在1.5ml离心管中加入20ul细胞裂解液,然后加入100ul的LARII溶液,混合后放入发光检测仪检测第一次发光值;
b) 然后加入Stop&Glo检测液,终止第一次发光,同时开始第二次发光,混合后放入发光检测仪检测第二次发光值。


参考文献:

  1. Biological basis for restriction of microRNA targets to the 3¢ untranslated region in mammalian mRNAs Shuo Gu1, Lan Jin1, Feijie Zhang1, Peter Sarnow2 & Mark A Kay1

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