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P-糖蛋白(p-gp)发光检测

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简介:

        P-糖蛋白(P-gp),也被称为多耐药基因1(MDR1)和ABCB1,是一种170kDa的完整的质膜蛋白。P-糖蛋白是一个ATP依赖性转运蛋白,能将许多结构不同的化合物逆向转运出细胞。Pgp在人体正常组织肝脏、肾脏、肠道、胎盘、血脑屏障以及淋巴细胞系和心脏内小动脉、毛细血管等部位都有分布。P-gp在人体正常组织内的分布以及对药物的逆向转运功能使得P-gp在药物的吸收、分布、代谢和清除方面具有重要意义。
        将P-gp的酶促反应与荧光素酶的发光反应相偶联,可以通过发光检测来确定P-gp的活性,从而筛选出影响P-gp活性的药物或化合物。

原理:

检测方法:

1. 试剂准备
a) 按照说明书,制备ATP检测试剂
b) 按照说明书,制备MgATP
c) 按照说明书,制备2.5×Pgp-Glo™ Assay Buffer
d) 按照说明书,使用Pgp-Glo™ Assay Buffer制备Pgp膜

2. 检测发光
a) 每孔中加入20ul 的Pgp-Glo™ Assay Buffer
b) 再加入20ul Pgp膜,37℃孵育5min
c) 然后加入10μl 25mM 的MgATP ,这样每孔中含有5mM的ATP
d) 混匀后,在37℃下孵育40min
e) 孵育后,加入50ul荧光素酶检测液,室温下孵育20min
f) 然后使用发光检测仪检测发光

参考文献:

  1. Boulton, D.W. et al. (2002) In vitro P-glycoprotein affinity for atypical and conventional antipsychotics. Life Sciences 71, 163–169.
  2. Litman, T. et al. (2003) Pumping of drugs by P-glycoprotein: A two step process? J. Pharm. Exp. Ther. 3F07(3), 846–853.
  3. Ambudkar, S.V. et al. (1999) Biochemical, cellular and pharmacological aspects of the multidrug transporter. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 39, 361–98.
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