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双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体

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简介:

原理:

1) 什么是双荧光素酶报告基因测试系统(DLR)?
DLR 测试系统灵敏,方便,在一个系统中用于测量两个单独的荧光素酶报告基因,萤火虫荧光素酶及海洋海肾荧光素酶 (Renilla reniformis) ,DLR测试系统可用于细胞裂解物及无细胞的翻译系统。

2) 有哪些海肾荧光素酶载体?
海肾荧光素酶载体pRL用于在转染的哺乳细胞中组成性地表达海肾荧光素酶。这类载体还有T7启动子,可用 T7RNA 聚合物在体外合成海肾荧光素酶,有4个不同的载体:

  1. pRL-SV40 载体
    pRL-SV40 载体含 SV40 增强子及早期启动子区域,可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。 pRL-SV40 载体还含有 SV40 的复制起始区,可在表达 SV40 大 T 抗原的细胞中,如 COS-1 , COS-7 细胞中,瞬时及附加体似地复制。
  2. pRL-CMV 载体
    pRL-CMV 载体含有 CMV 极早增强子及启动子,可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。
  3. pRL-TK 载体
    pRL-TK 载体含 HSV 胞嘧啶激酶启动子区域,在多种细胞中组成性地弱表达海肾荧光素酶。
  4. pRL-null 载体
    pRL-null 载体缺真核启动子及增强子,在海肾荧光素酶基因的上游含有多克隆位点。

3) 用双报告基因有何优点?
一般地说,实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达,而另一个报告基因作为内对照,以提供实验报告基因测试的归一化。将实验报告基因的活力与内对照报告基因的活力作归一化可消除实验中不同测试间所固有的变化,这些变化减弱实验准确度,其中包括培养细胞的数目及活力的差异,细胞转染及裂解的效率。海肾荧光素酶可用作对照报告基因及实验报告基因。在双荧光素酶报告基因测试中,将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因,海肾荧光素酶作为对照报告基因。

4) 相比用 CAT 或 β - 半乳糖苷酶对表达数据作归一化,双荧光素酶报告基因测试系统有何优点?

用双荧光素酶报告基因测试 (DLR) 有几个优点:

  • 快速
    DLR 测试不需保温或对样品作预处理。用被动裂解液将共转染有萤火虫及海肾荧光素酶基因的细胞裂解,制备细胞抽提物。加入 Stop&Glo 试剂后,可同时湮灭萤火虫荧光素酶活力并激活海肾荧光素酶发光,需立即测试海肾荧光素酶活性。在几秒钟内可完成荧光素酶测试实验并作定量测试。而其他一些如 CAT 及 β -gal 的报告基因系统在定量前需要长时间的保温。
  • 灵敏度
    萤火虫及海肾荧光素酶的测试线性范围,是酶浓度的 7 个对数。其他报告基因的灵敏度及线性应答受限。通常不存在内源荧光素酶使背景活力低。
  • 方便
    在单管中完成测试,不需拆分样品,可用被动裂解液将培养在 96 孔板中的细胞快速裂解。

5) 海肾荧光素酶与萤火虫荧光素酶相比的相对活性如何?
在ATP,镁,及氧存在时,萤火虫荧光素酶作用于甲虫荧光素,而来源于海洋腔肠(Renilla reniformis)的荧光素酶在氧的存在下作用于海肾荧光素。

6) 将两个报告基因载体作共转染应用什么条件?
当用双荧光素酶报告基因测试系统来测量等重量的萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶时,可观察到它们释放的光几乎相等。萤火虫荧光素酶的分子量为 61kD ,而海肾荧光素酶的分子量为 36kD ,当测试等重量的两个酶时,所测的海肾荧光素酶分子实际多 69% 。如以每摩尔为基础,据实验确定,用双荧光素酶报告基因试剂测试的萤火虫荧光素酶的荧光强度比海肾荧光素酶强大约 53% 。

共转染质粒所含启动子间的反式效应有可能会影响到报告基因的表达。当对照或实验报告基因载体含有很强的启动子 / 增强子时,需要特别加以注意。载体 pRL 上的 TK , SV40 , CMV 调节因子据报道可在大多数哺乳类细胞中表达,但它们在不同细胞中的表达水平不同。载体 pRL-TK 中 HSV 胞嘧啶激酶启动子相对较弱,使海肾荧光素酶的组成性表达成低到中度水平。早 SV40 极早 CMV 的增强子 / 启动子转录水平高,当实验载体所具有的调节因子较强时,这类启动子不太适用于双报告基因实验。
为使实验报告基因及对照报告基因的基因表达相对独立,每次实验时转染混和液中载体 DNA 的量及共转染报告基因载体的比例需作优化。可采用实验载体与共转染报告基因载体的组成比在 10 : 1 到 50 : 1 或更大的范围,这有利于抑制启动子间的交互作用。有时为有利于实验,共转染混和液中的实验载体应选择为少量部分。

7) 需用荧光测试仪对双荧光素酶报告基因测试系统的荧光素酶作测定吗?
作 DLR 测试时应使用荧光测试仪。液闪仪的灵敏度相比太低,不易获得可重复的结果。

8) 作荧光素酶报告基因测试时,如何使用单或双加样的荧光测试仪?
对于单加样的荧光测试仪,在管子中预先加入荧光素酶测试试剂 II ,再加入细胞裂解物并测萤火虫荧光素酶的活力,接下来,用荧光测试仪上的加样管加入 Stop&Glo 试剂,并测海肾荧光素酶的活力。
对于双加样的荧光测试仪,在管子中加入细胞裂解物后,放入荧光测试仪中,从加样管 I 中加入荧光素酶测试试剂 II 并测萤火虫荧光素酶的活力,从加样管 II 中加入 Stop&Glo 试剂,并测海肾荧光素酶的活力。
需对背景作预测试的荧光测试仪需关闭这一功能。

9)如何从荧光测试仪中清理 Stop&Glo 试剂?
Stop&Glo 试剂中的一个荧光素酶湮灭成份对塑料物质有一定的亲和力。这一组份对于自动加样管的塑料管及吸管的内壁有可逆结合。接触过 Stop&Glo 试剂的加样管如没充分清洗,会将残留的湮灭试剂遗漏到随后通过加样管的溶液中。如这样的情况发生,则非常少量的污染湮灭试剂就会极大地抑制萤火虫荧光素酶的活力。因此在使用萤火虫荧光素酶测试中,如要用自动法加样 LARII ,则需对已接触 Stop&Glo 试剂的加样管作充分的清洗。如荧光测试仪有两个加样管,则要将每个管子固定加样一种溶液。在完成一次实验后必须彻底清洗,请按下面的步骤清洗管子并维修仪器。

普通加样管清洗步骤:

  1. 用 3 倍于吸管箱体积的去离子水反复清洗加样管子以除去 Stop&Glo 试剂。
  2. 准备 70% 的乙醇作为清洗试剂,用 5ml70% 的乙醇将箱及加样管完全清洗,可将加样管浸泡在这一溶液 30 分钟后,再用去离子水清洗。
    注意:构造加样管子的材料有很大差异,有的吸管浸泡清洗试剂的时间需超过 30 分钟。配有 Teflon 管子的荧光测试仪不会有太大问题,而其他如 Tygon 浸泡清洗试剂的时间需超过 12-16 小时(过夜)以完全除去 Stop&Glo 试剂。
  3. 用 3 倍于吸管箱体积的去离子水反复清洗加样管子以除去乙醇。

Turner Designs TD –20/20 荧光测试仪中加样管的清洗:

TD –20/20 荧光测试仪需 5 次预循环以 100% 地将加样吸管中的溶液完全清除,然后按下列方法清除残留的 Stop&Glo 试剂:

  1. 用去离子水清洗吸管 10 次,清除残留的 Stop&Glo 试剂。
  2. 再用 70% 乙醇清洗 10 次,并用清洗液将管子浸泡 30 分钟。
  3. 再用去离子水清洗 10 次,清除残留的乙醇。

10) 如何保存 Stop&Glo 试剂?
将一定体积的 Stop&Glo 试剂保存在玻璃管及硅化的聚丙烯管子中,放在 -70oC 。在未作处理的塑料管中,这一试剂不稳定。

11) 50×Stop&Glo 底物储存液的保存条件已作改变! 1999 二月。
Stop&Glo 底物溶于 Stop&Glo 底物试剂中,所得 50× 贮液在 -20oC 会沉淀。当沉淀发生时, 50× 贮液的颜色会改变,如用于测定海肾荧光素酶,则酶活力会降低。
最好新鲜配制 50× 贮液,并立即使用,如需保存,则将 50× 贮液保存 -70oC 达 4 周,活力不会改变。

12) 被动裂解液与报告基因裂解液及细胞培养裂解试剂有何差别?这三种裂解液能同双荧光素酶报告基因测试系统 (DLR) 一同使用吗?
被动裂解液经特别配方以最有效地减小海肾荧光素酶底物海肾荧光素的自发荧光水平。两个荧光素酶在被动裂解液中,室温可保存 6 小时。报告基因裂解液原则上可用于制备细胞裂解物,并用于 DLR 测试,但实际上这不可行,因较被动裂解液会导致高一些的海肾荧光素的自发荧光水平。细胞培养裂解试剂的海肾荧光素的自发荧光水平很高,不能被采用于制备 DLR 测试系统的细胞裂解物。

13) 被动裂解液能裂解培养的植物细胞吗?它能裂解哺乳动物组织所得的初级细胞吗?
被动裂解液不能裂解植物细胞。它能裂解一些类型的哺乳初级细胞。一种细胞能否被它裂解需作测试。

14) 加入 Stop&Glo 试剂后,还残留有萤火虫荧光素酶活性吗?
萤火虫荧光素酶能立即被 Stop&Glo 试剂湮灭,残留有萤火虫荧光素酶活性低于 0.001% 。

15) 荧光素酶测试试剂 II 是否是荧光素酶测试系统的同一试剂?
荧光素酶测试试剂 II 不是荧光素酶测试系统的同一试剂。荧光素酶测试试剂 II 经特定配方与 Stop&Glo 试剂混合,以最有效地测试海肾荧光素酶活性。普通荧光素酶测试试剂不能替代用于 DLR 系统。

16) 在测试阶段海肾荧光素酶活性的逐步丧失会使结果有何波动?
当用自动加样管加 Stop&Glo 试剂时,不会带来波动。用手动加 Stop&Glo 试剂时,据观察,海肾荧光素酶测试结果的波动可被忽约。

检测方法:

参考文献:

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