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应用PicoGreen荧光染料进行DNA精确定量

阅 29473次 / 原平皓生物
关键词: DNA精确定量, DNA定量, 荧光染料, Picogreen

简介：

        对微量的双链 DNA 进行定量在各种生物学应用中都显得非常重要,例如 cDNA 文库的构建；用于亚克隆的 DNA 片段的纯化；定量 DNA 扩增产物,在药物中DNA 分子残留的测定等 。检测核酸浓度*常用的方法就是检测核酸在 260nm ( A260 )处的光吸收，这一方法主要的缺点是单链核苷酸和单核苷酸会产生干扰信号，核酸样品中的杂质也会影响结果。光吸收不能区分 DNA 和 RNA, 灵敏度也相对较低(用 1cm 的比色杯在 A260 值为 0.1 时相对应的双链 DNA 浓度为 5 μ g/ml )。
        Picogreen染料是一种新型的dsDNA染料：其检测灵敏度高，可检测到pg级DNA；检测范围宽，可跨越４个数量级；特异性好，基本不受ssDNA和RNA的影响，并且可以耐受一定浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白等干扰。目前使用Picogreen染料定量检测DNA已经广泛用于生物学检测，并被2010年版《中华人民共和国药典》选为药物残留DNA定量方法。

原理：

检测方法：

2．所需器材
ModulusTM单管型多功能检测仪（9200-003）
 微量适配器（9200-928）
 微量比色皿
 PicoGreen试剂
3． 试验方案
3.1 试剂准备
        PicoGreen是以1mL的浓缩液形式保存在无水的 DMSO（二甲基亚砜）中。实验当天，配制 2 × PicoGreen试剂的工作溶液，用 1×TE按 1:200的比例稀释浓缩液（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH7.5）。如果要准备足够的工作溶液测定 20个样品，可在 20mL1x TE中加入 100μL PicoGreen dsDNA定量试剂。由于试剂容易吸附到玻璃表面，要在塑料容器中配制。 PicoGreen试剂见光易降解，所以应将配好的溶液用箔包住或放置暗处避光保存。
溶液*好在配制好数小时内使用，以保证*佳结果。
3.2 DNA标准曲线
3.2.1标准品工作液的配制：Sigama小牛胸腺嘧啶DNA干粉（货号：D4522-1MG）1mg（Tris，Nacl等浓度已成标准体系），加入1mL双蒸水，配制成1mg∕mL的标准品工作液；
3.2.2标准品工作液稀释：
（1）母液稀释：取10ul（1mg∕mL）标准品工作液加入到990ul TE溶液中，浓度稀释成10ug∕mL，取10ul（10ug∕mL）标准品工作液加入到990ul TE溶液中，浓度稀释成100ng∕mL；
（2）倍比稀释：取800ul （100ng∕mL）的标准品工作液加入到200ul TE溶液中，浓度达到80ng∕mL（药典规定：荧光染色方法DNA含量在1.25-80 ng/mL范围线性较好, 该法DNA检出限为0.3 ng/ml），取500ul （80ng∕mL）的标准品工作液加入到500ul TE溶液中，浓度稀释到40ng∕mL；依次倍比稀释，配成20ng/ml、10ng/ml、5.0ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml的标准品溶液；

3.2.3标准曲线的制备：倍比稀释后的各梯度标准品溶液和染料工作液各取100ul混匀，避光室温放置5min。

3.2.4使用ModulusTM单管型多功能检测仪的Blue荧光模块检测样品的荧光值：将混合后的溶液加入微量比色皿，确信不要在样品中引入气泡，轻轻地弹微量检测皿的外部，可以驱散气泡。以1×TE缓冲液为blank，测定样品和空白对照的荧光值；用标准品溶液的浓度（ng/ml）对应的荧光强度作直线回归，制备标准曲线

4 样品分析
        在每个样品中加入等体积的 2×PicoGreen工作溶液（ 3.1节准备），充分混匀，避光于室温下孵育5分钟。将孵育好的溶液加入微量比色皿，使用ModulusTM单管型多功能检测仪检测其荧光值。将样品溶液的荧光强度代入回归方程，求出样品的残余DNA含量（ng/ml）。

参考文献：

  1. 无

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