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应用PicoGreen荧光染料进行DNA精确定量

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简介:

        对微量的双链 DNA 进行定量在各种生物学应用中都显得非常重要,例如 cDNA 文库的构建;用于亚克隆的 DNA 片段的纯化;定量 DNA 扩增产物,在药物中DNA 分子残留的测定等 。检测核酸浓度最常用的方法就是检测核酸在 260nm ( A260 )处的光吸收,这一方法主要的缺点是单链核苷酸和单核苷酸会产生干扰信号,核酸样品中的杂质也会影响结果。光吸收不能区分 DNA 和 RNA, 灵敏度也相对较低(用 1cm 的比色杯在 A260 值为 0.1 时相对应的双链 DNA 浓度为 5 μ g/ml )。
        Picogreen染料是一种新型的dsDNA染料:其检测灵敏度高,可检测到pg级DNA;检测范围宽,可跨越4个数量级;特异性好,基本不受ssDNA和RNA的影响,并且可以耐受一定浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白等干扰。目前使用Picogreen染料定量检测DNA已经广泛用于生物学检测,并被2010年版《中华人民共和国药典》选为药物残留DNA定量方法。

原理:

检测方法:

2.所需器材
ModulusTM单管型多功能检测仪(9200-003)
 微量适配器(9200-928)
 微量比色皿
 PicoGreen试剂
3. 试验方案
3.1 试剂准备
        PicoGreen是以1mL的浓缩液形式保存在无水的 DMSO(二甲基亚砜)中。实验当天,配制 2 × PicoGreen试剂的工作溶液,用 1×TE按 1:200的比例稀释浓缩液(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,pH7.5)。如果要准备足够的工作溶液测定 20个样品,可在 20mL1x TE中加入 100μL PicoGreen dsDNA定量试剂。由于试剂容易吸附到玻璃表面,要在塑料容器中配制。 PicoGreen试剂见光易降解,所以应将配好的溶液用箔包住或放置暗处避光保存。
溶液最好在配制好数小时内使用,以保证最佳结果。
3.2 DNA标准曲线
3.2.1标准品工作液的配制:Sigama小牛胸腺嘧啶DNA干粉(货号:D4522-1MG)1mg(Tris,Nacl等浓度已成标准体系),加入1mL双蒸水,配制成1mg∕mL的标准品工作液;
3.2.2标准品工作液稀释:
(1)母液稀释:取10ul(1mg∕mL)标准品工作液加入到990ul TE溶液中,浓度稀释成10ug∕mL,取10ul(10ug∕mL)标准品工作液加入到990ul TE溶液中,浓度稀释成100ng∕mL;
(2)倍比稀释:取800ul (100ng∕mL)的标准品工作液加入到200ul TE溶液中,浓度达到80ng∕mL(药典规定:荧光染色方法DNA含量在1.25-80 ng/mL范围线性较好, 该法DNA检出限为0.3 ng/ml),取500ul (80ng∕mL)的标准品工作液加入到500ul TE溶液中,浓度稀释到40ng∕mL;依次倍比稀释,配成20ng/ml、10ng/ml、5.0ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml的标准品溶液;

3.2.3标准曲线的制备:倍比稀释后的各梯度标准品溶液和染料工作液各取100ul混匀,避光室温放置5min。

3.2.4使用ModulusTM单管型多功能检测仪的Blue荧光模块检测样品的荧光值:将混合后的溶液加入微量比色皿,确信不要在样品中引入气泡,轻轻地弹微量检测皿的外部,可以驱散气泡。以1×TE缓冲液为blank,测定样品和空白对照的荧光值;用标准品溶液的浓度(ng/ml)对应的荧光强度作直线回归,制备标准曲线

4 样品分析
        在每个样品中加入等体积的 2×PicoGreen工作溶液( 3.1节准备),充分混匀,避光于室温下孵育5分钟。将孵育好的溶液加入微量比色皿,使用ModulusTM单管型多功能检测仪检测其荧光值。将样品溶液的荧光强度代入回归方程,求出样品的残余DNA含量(ng/ml)。

参考文献:

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