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荧光素酶检测系统及荧光素酶报告基因载体

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简介:

原理:

1) 什么是荧光素酶检测系统?如何使用荧光素酶报告基因载体?
将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中,可用荧光素酶检测系统灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达。 1986 年萤火虫荧光素酶基因被用作测定基因表达的报告基因,获得广泛的应用。在荧光素酶的催化下,虫荧光素被氧化并释放一个光子。可用荧光检测仪 (比如, Turner DesignsTD-20/20, Promega 公司目录号 E2041) 及液闪计数仪对荧光作定量测定。荧光素酶报告基因载体用萤火虫荧光素酶基因作为报告基因,可对启动子及增强子序列作快速及方便的分析。 pGL3 及 pGL2 系列载体,含 SV40 启动子及增强子的不同组合,有助于分析 DNA 片段的转录活性。具体情况如下:

  1. pGL2- 及 pGL3-Basic 载体不含启动子及增强子,将可能的启动子序列克隆到荧光素酶基因的上游,可测定其是否具有启动荧光素酶基因表达的活性。
  2. pGL2- 及 pGL3-Promoter 载体含 SV40 的启动子可驱动荧光素酶基因表达。插入可能的增强子可增加荧光素酶基因的表达。
  3. pGL2- 及 pGL3-Enhancer 载体在荧光素酶基因下游插入了 SV40 的增强子,这可用于测定能增强荧光素酶基因表达的启动子。
  4. pGL2- 及 pGL3-Control 载体含 SV40 的启动子及增强子,能产生高水平的荧光素酶基因表达。可作为检测转染频率的有效对照。

2) 荧光素酶报告基因与其他分子相比有哪些优点?

优点包括:

  • 荧光素酶检测系统是非放射性。
  • 比氯霉素乙酰转移酶检测系统 ( CAT) 及其他报告基因系统更快。
  • 荧光素酶检测系统比 CAT 灵敏 100 倍。
  • 荧光素酶在哺乳细胞中的半衰期为 3 小时,在植物中的半衰期为 3.5 小时。由于半衰期短,故启动子力的改变会即时导致荧光素酶活性的改变,而荧光素酶不会积累。相反, CAT 在哺乳细胞中的半衰期为 50 小时。
  • 荧光素酶浓度在 10 -16 M ( 10pg/L) 到 10 -8 M ( 1mg/L) 范围内,荧光信号强度与酶浓度成正比。在理想条件下,可检测到 10 -20 摩尔的荧光素酶。

3) Promega 公司的荧光素酶检测系统与其他常用的荧光素酶检测系统相比如何?
Promega 公司的荧光素酶检测系统比一般的方法,灵敏及简单,产生的光稳定,可参考 Promega Notes 54, 20 (1995),Jones D P, Sherf B A , Wood K V 对荧光素酶检测系统所作的比较。

4) pGL3 荧光素酶报告基因载体与 pGL2 (a) 荧光素酶报告基因载体有何区别?
pGL3 荧光素酶报告基因载体在设计上含有许多改进。改进细节可见 pGL3 荧光素酶报告基因载体技术手册 TM033 。对荧光素酶报告基因编码序列所作的改变见 pSP-luc+ 载体技术手册 TB208 。这些变化可增强荧光素酶检测系统的灵敏度,有利于载体的使用,降低质粒与细胞因子的意外结合。具体而言:

  • 替换了 C- 端的氨基酸,使荧光素酶位于胞质内,增强荧光素酶检测系统的信号。
  • 含优化的真核 ( Kozak) 翻译起始序列及改进的密码子编码,增强在动物及植物中的表达。
  • 除去两个 N —糖基化位点。
  • 在 DNA 序列上作了很多改变,消除了荧光素酶编码区内长的回文结构及常用的限制性内切酶位点。

5) 报告基因裂解液与细胞培养裂解试剂间有何区别?
报告基因裂解液使荧光素酶,β-半乳糖苷酶, CAT 报告基因酶能从共转染实验所得的同一抽提物中,进行酶活力的测定。用细胞培养裂解试剂制备的抽提液适用于荧光素酶检测系统,与β-糖苷酶,或 CAT 报告基因酶测试系统不相容。

6) 5× 报告基因裂解液的组分如何?
5× 报告基因裂解液的组分非常独特。

7) 用冻融法制备的细胞裂解物能用于荧光素酶检测系统吗?
应避免使用冻融法制备抽提物,多轮冻融会极大降低荧光素酶活性,降低的程度随细胞株而变。用报告基因裂解液制备抽提物时,单次冻融有助于细胞裂解。但有些研究人员发现单次冻融所得的抽提物会使荧光素酶活性升高。

8) 用荧光检测仪作荧光素酶检测时需用自动加样系统吗?
不需用自动加样系统。普通的荧光素酶检测系统产生光闪烁,在酶与底物混合后很快地衰减。 Promega 公司的荧光素酶检测系统荧光素酶的酶活性高,产生的光的强度高,在测试的几分钟内可保持稳定。

9) 液闪计数仪能用于荧光素酶检测吗?
液闪计数仪作一些改变后,可测定荧光素酶活性。读数时需对样品作大的稀释 (用含 1mg/ml BSA 的 1× 报告基因裂解液或 1× 细胞培养裂解试剂)

  • 将样品直接放入透明或半透明的测试瓶中,应完全覆盖瓶底。不能加闪烁液。另外,也可将样品放在小离心管中,再放入测试瓶中。
  • 液闪计数仪上的偶合循环应关掉,如不能被关掉,也可通过测量 cpm 减去背景 cpm 读数开方,确定荧光素酶读数与 cpm 的线性关系。可用空白水或非转化细胞抽提物来测定背景 cpm 。
  • 反应应在读数前立刻进行,每一次读数 1-5 分钟。液闪计数仪用手动测定。

10) 为什么需要对带有偶合循环的液闪计数仪的结果作调整?
从荧光素酶测试反应中所释放的光子,撞击光扩增管的概率与反应中荧光素酶的浓度成正比。如液闪计数仪的偶合循环在运行,则光子需同时撞击两个光扩增管才能被液闪计数仪记录。而两个独立事件 (光子释放和撞击 PMT) 同时发生的概率是两个事件单独发生概率的乘积。因荧光素酶反应所释放的任一个光子撞击 PMT 的概率相同,则两个光子撞击两个 PMT 的概率等于一个光子撞击一个 PMT 的概率开方。取 cpm 的开方,则可将液闪计数仪的读数 cpm 正比于酶浓度。

11) 荧光素酶检测系统需要制备标准曲线吗? Promega 公司提供纯化的荧光素酶吗?
不需作标准曲线。荧光素酶检测系统用于比较样品的相对活性。如需作标准曲线,则需从非转染的细胞所得提取物作稀释以校正抽提物对测试的影响。通过标准曲线,则荧光素酶的量与光的测量值相关联。可从 Promega 公司购得纯化的荧光素酶 ( E1701 , E1702) ,作标准曲线。

12) 荧光素酶基因转录物的长度是多少?
克隆序列决定实验所得转录产物的长度。从荧光素酶报告基因对照载体所得的荧光素酶基因转录产物的长度为 2650nt 。从 pGL2 对照载体所得转录产物的长度是 2720 nt ,这是非加工的转录产物的长度。

13) 荧光素酶蛋白的长度是多少?
荧光素酶蛋白单体的分子量为 62kDa 。

14) 有荧光素酶的抗体吗?
可从 Promega 公司购得抗荧光素酶的抗体 (目录号 G7451) 。

15) 用报告基因裂解液与细胞培养裂解试剂制备的细胞裂解物能作蛋白浓度测定吗?
用报告基因裂解液与细胞培养裂解试剂制备的细胞裂解物,可用一种兼容去污剂的蛋白测试方法确定其浓度。比如可用 Bio-Rad DC 蛋白测试方法 (Bio-Rad 目录号 500-0116) 或用 Pierce BCA 蛋白测试方法 (Pierce 目录号 23225) 。用细胞培养裂解试剂制备的细胞裂解物因含 DTT 需作稀释。

检测方法:

参考文献:

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