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荧光素酶报告基因检测影响因素及注意事项

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简介:

1. 报告基因检测受多种因素影响(载体状态、细胞状态、转染量、转染效率、裂解效率、加样精度、检测过程等),因此同批次样品检测值也可能出现浮动。所以实验一般需要做3个或3个以上复孔,并且引入另一个报告基因作为内参。

2. 细胞培养时间不宜过长,12-36h内最好;长时间培养后,细胞难裂解

3. 双荧光素酶报告基因的载体选择:
    a) 萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4的载体或自己构建相应的载体;
    b) 海肾荧光素酶建议选取phRL-TK或pGL-4代载体或自己构建相应的载体。建议海肾载体不使用强启动子(如SV40、CMV),而选用中等强度的启动子(如TK)

4. 双荧光素酶报告基因的载体比例:根据实验具体情况调整。建议作一个预实验来调整(萤火虫载体与海肾载体比例分别用1:10、1:20、1:50、1:100),萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。

5. 最适反应温度:室温(20-22℃)。各个组分(细胞裂解产物,底物工作液等)都需要调整到室温。

6. 双荧光素酶反应体积:20ul(细胞裂解产物)-100ul(萤火虫荧光素酶底物)-100ul(海肾荧光素酶底物),底物量可根据实际情况调整,但一定要保证底物过量,不然会造成检测结果出现大的偏差

7. 细胞裂解液无需离心去沉淀。

8. 被动裂解液存放:5×的裂解液,-20℃存放;1×裂解液,建议现用现配,4℃不能超过1个月

9. 配好的工作液存放:萤火虫检测工作液,-20℃一个月;-80℃一年;海肾检测工作液,建议现用现配,-20℃不能超过15天,反复冻融6次活性损失≤15%

10. 细胞裂解产物存放:常温6小时;4℃16小时,-20℃一个月;-80℃半年或更长

11. 裂解产物与底物混合(手动加样):要求混合快速、混合时间一致

12. 检测结果:Modulus单管型检测仪的检测范围0-2千万,Modulsu微孔板检测仪的检测范围0-2亿。但实验结果最好落在在“千-百万”这个范围中,这时受实验背景影响最小,线形最好。
        a) 空管检测仪器背景约100左右,样品检测结果最好能比样品高出一个数量级,即检测值上千。
        b) 检测值过小(比如300):说明样品中荧光素酶表达过低,可能与细胞状态、转染条件、转染量、载体结构、启动子活性等有关,如果条件允许,调整各个影响因素,提高发光值。
        c) 检测值过高(比如1千万):说明样品中荧光素酶表达过高,可能会接近或超过仪器检测上限,建议通过降低转染量或减少检测体积等降低发光。长期检测强光,对仪器有一定的损害。

13. 半衰期:
        a) 单报告检测试剂盒(E1500)中,萤火虫荧光素酶发光半衰期约12min
        b) 双荧光素酶检测试剂盒(E1910)中,萤火虫荧光素酶发光半衰期约9min,海肾荧光素酶发光半衰期约2min

原理:

检测方法:

参考文献:

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