发光检测

荧光检测

科学仪器目录

应用Hoechst荧光染料进行DNA精确定量

阅 9390次 / 原平皓生物

简介:

        对微量的双链 DNA 进行定量在各种生物学应用中都显得非常重要,例如 cDNA 文库的构建;用于亚克隆的 DNA 片段的纯化;定量 DNA 扩增产物,在药物中DNA 分子残留的测定等 。常规的DNA含量的检测方法是在 260nm(A260)处测其吸光值。这种方法的主要缺点是核苷酸、单链核酸和蛋白质对信号的影响很大,并且还会受到核酸制备过程中污染物的干扰,无法区分 DNA和 RNA,而且这种方法不灵敏( 5μg/mLdsDNA溶液 A260=0.1)。
        Hoechst 染料是一种非常灵敏的荧光染料。 H33258 选择性的与双链 DNA 结合。在有蛋白的情况下荧光信号并不显著增加,因此可检测和定量低至 10 ng/ml 的 DNA 。

原理:

检测方法:


2. 所需材料
ModulusTM单管型多功能检测仪(货号:9200-000或9200-002)
●紫外荧光模块(货号:9200-041)
●微量比色杯(货号:7000-950)和微量适配器(货号:9200-928)或比色杯(货号:7000-959)
●Hoechst 33258 10 mg/ml (分子探针 H3569)
●10XTNE储存缓冲液
●0.45μm的过滤水

3. 考虑因素
3.1 DNA样品中的AT含量会影响到Hoechst 33258-DNA荧光,因此,检测样品时设一对照是非常重要的,小牛胸腺DNA由于是双链、高度聚合并含有大约58%的AT(42% GC)而经常被用作动植物DNA的对照。对于细菌DNA来说,它会有不同的对照,因为不同菌种的AT含量变化较大。
3.2 不同构造的质粒DNA(超螺旋型、螺旋型、环形和、线型)会有不同的Hoechst 33258结合效果。因此,选择一种与样品特征相似的标准品对照也是很重要的。
3.3 在单链基因组DNA上的Hoechst 33258荧光只有在双链基因组DNA上的一半,单链DAN片段的荧光量并不会与单链DAN的浓度成比例地引发荧光。
3.4 用于全细胞DNA抽提的缓冲液对后期的检测没有什么影响。
3.5 少量的去污剂(<0.01% SDS)对检测也没有什么影响。
3.6 含盐浓度为3M NaCl的DNA抽提样对检测没有影响。为获得较强的荧光,纯化的DNA样品中至少要含有200mM的NaCl,未纯化样品中需含2.0-3.0M的NaCl。对于未纯化样品来讲,较高的盐浓度会将结合在DNA上的蛋白裂解下来,便于染料分子的结合。
3.7 RNA对检测没有影响,因为Hoechst 33258通常并不与RNA结合。来之于RNA的荧光信号通常会低于相同DNA浓度的1%。

4.试剂制备
4.1 Hoechst 33258储存液
        1 mg/ml Hoechst 33258:1ml的Hoechst 33258(10 mg/ml)加9ml的用0.45μm滤膜过滤的蒸馏水稀释而成。
        注:Hoechst 33258可能会致癌和导致基因突变,操作时须带手套、面罩,并且在通风橱内操作。
4.2 10XTNE储存缓冲液
        溶解于800ml蒸馏水中:12.11g Tris碱[Tris(羟甲基)氨基甲烷],分子量=121.14;3.72g EDTA乙二胺四乙酸,二钠盐,二水合物,分子量=372.20;116.89g 氯化钠,分子量=58.44。用浓盐酸调节溶液PH至7.4,补加蒸馏水定容至1000ml,使用前用0.45μm滤膜过滤,4℃可保存3个月。
        注:PH和氯化钠浓度对于Hoechst试剂和DNA的结合至关重要。
        1倍的TNE:用90ml蒸馏水(0.45μm滤膜过滤)稀释10ml 10倍的TNE。
4.3 准配2倍的染料液用于10-1000 ng/ml的DNA:用100ml的1倍的TNE稀释20µl Hoechst 33258 储存液    (1 mg/ml),室温放置,现用现配,一旦染料加入千万别再过滤!
4.4 小牛胸腺DNA标准液:准备溶解在1倍TE浓度为1 mg/ml的小牛胸腺DNA储存液,轻击小管充分混匀,4℃可保存3个月。

5. 样品检测
5.1荧光模块的安装
5.1.1关掉多功能机电源开关,根据操作手册插入紫外荧光模块
5.1.2打开电源开关,校准前先预热1min。
5.1.3用于10X10mm比色杯的实验方案
5.1.3.1准备1ml 2000 ng/ml dsDNA标准液校准比色杯。
5.1.3.2以1:1的比例加2倍的染料工作液到2000 ng/ml dsDNA标准液中,终浓度为1000 ng/ml。
5.1.3.3在另外的小管中加入空白对照液:2倍的染料工作液以1:1的比例加入1X TNE缓冲液,最少2ml。
5.1.3.4校准多功能机用1000 ng/ml。
        注:用一个和检测样品浓度相同或相近的标准样优化系统,使检测更精确。例如,若检测样品浓度在300 ng/ml,要用一个500 ng/ml标准DNA样。标准样浓度应该是与检测样浓度相同或超出100 ng/ml。
5.1.3.5保存这次校准以供将来使用(可选)
5.1.3.6向1ml样品的小管中加1ml 2倍的染料液,需要的话,可以用1倍TNE稀释样品。
        注:小管中溶液体积最少需2ml。
5.1.3.7放入多功能机读数前平衡样品和染料混合液5min。
5.1.3.8样品和染料浓度会在多功能机显示屏上显示。
        注:由于染料的加入,最终浓度要小于起始浓度的1/2。另外也要考虑到起始样品的稀释。

5.1.4使用微量比色杯的实验方案
5.1.4.1标准液制备。将1mg/ml 的DNA储存液用1倍TNE稀释到2μg/ml,加相等体积的2倍的染料工作液,而后重复步骤4.4,充分混合。
        注:用一个和检测样品浓度相同或相近的标准样优化系统,使检测更精确。例如,若检测样品浓度在300 ng/ml,要用一个500 ng/ml标准DNA样。标准样浓度应该是与检测样浓度相同或超出100 ng/ml。
5.1.4.2空白对照液制备。在另一只小离心管中加入相同体积的样品缓冲液(通常是1倍TNE)和2倍的染料工作液。
5.1.4.3混合小离心管中加有2倍染料工作液的样品。
        注:在微量比色杯中不要混合检测样、标准样或有染料液的空白对照液。
5.1.4.4取100μl检测样、标准样和空白对照液分别加到微量比色杯中,室温避光静置2-5min。
        注:不要在微量比色杯中引入气泡,它会导致读数错误。
5.1.4.5校准多功能机用1000 ng/ml。
5.1.4.6保存这次校准以供将来使用(可选)
5.1.4.7微量比色杯中样品所测浓度会在多功能机显示屏上显示。
        注:由于染料的加入,最终浓度要小于起始浓度的1/2。另外也要考虑到起始样品的稀释。

参考文献:

*如果您在实验中遇到任何问题, 请与我们的技术人员沟通, 我们将提供帮助.
联系电话: 010-5158 2336转803 电子邮箱: helpyph-bio.com