应用荧光素酶-ATP法检测活性污泥的生物活性
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原平皓生物
简介：
众所周知，活性污泥工业的处理效率与污泥微生物的活性密切相关。微生物活性越大，处理效果就越好；反之，效果就越差。通常我们使用混合液悬浮固体浓度(MLSS)、混合液挥发悬浮固体浓度(MLVSS)、污泥沉降比(SV)、污泥容积指数(SVI) 、污泥龄(TS) 等指标来衡量微生物活性，并以F/M的形式进行评述。随着研究的深入及测量技术的进步，人们发现用MLSS(或MLVSS) 来衡量活性污泥中微生物的活性不够确切，因为MLSS(或MLVSS) 中也包括了与净化无关的非活性物质在内。即不能将活的细胞与有机残体(如已经死亡的微生物残体) 区分开，用它来作为衡量生物量的指标并不准确。为此，人们开始尝试用脱氢酶活性(DHA)、比耗氧速率(SOUR) 和三磷酸腺苷(ATP) 等生物指标来反映微生物活性。而在这些指标中，ATP广泛存在于生物细胞内，是生物体内能量代谢的重要产物和细胞代谢可利用能量的携带者，并参与生物体内蛋白质、脂肪的生化合成、吸收等反应。所以，通过测定ATP含量的多少，可以直接反映细胞活性、微生物的数量，而且它的测定方法简单快速。将ATP应用于污泥生物活性的检测，已经引起广泛地关注。
原理：
ATP含量检测可以用吸光度检测、发光检测或同位素等方法实现。传统的吸光度检测法，检测灵敏度低，线性范围窄，难以准确检测ATP状况。而应用荧光素酶发光方法检测ATP，具有*高的灵敏度和*宽的检测范围，而且简便、快速，是目前*为流行的方法。该方法基于萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）催化荧光素氧化，消耗ATP，发出光子的高效发光反应，具有发光效率*高、发光量与ATP含量呈很好的线性关系的特点。
检测方法：
1．所需器材
2.1 试剂准备
（1）稀释Lysis Buffer：将Lysis Buffer室温溶化，用无菌水5倍稀释使用。
（2）配制L/L检测液：L/L Buffer室温溶化后，作为稀释液将L/L substrate进行50倍稀释，配制成L/L检测液。
（3）ATP标准品的配制：用Lysis Buffer将ATP标准品进行10倍梯度稀释，制作10-12至10-17mol/μl浓度的ATP标准样品。
2.2 ATP标准曲线
（1）取10-12至10-17mol/μl浓度的ATP标准样品各10μl，分别加入50μl的L/L检测液，混合后放入发光检测仪检测（发光强度RLU）。
（2）根据ATP标准品与相应发光强度制作ATP-RLU标准曲线。
2.3 活性污泥样品检测
（1）抽取一定量的活性污泥，并混合为均匀悬液。
（2）取10μl活性污泥悬液，加入50μl Lysis Buffer，混合均匀，静置5分钟；然后加入50μl L/L检测液，并混合均匀，放入检测仪检测，获得总ATP发光强度。
（3）取10μl活性污泥悬液，加入50μl 纯水，混合均匀，静置5分钟；然后加入50μl L/L检测液，并混合均匀，放入检测仪检测，可获得水中游离ATP发光强度。（通常游离ATP占总ATP的比例小于1%）
（4）将样品发光强度带入标准曲线方程，获得样品中ATP含量。
（5）通过检测不同处理后的活性污泥或不同来源的活性污泥，可获得活性污泥的活性变化。
- 专用检测仪
- 专用检测试剂盒（包含ATP标准品，裂解液，检测液）
- 活性污泥样品
2.1 试剂准备
（1）稀释Lysis Buffer：将Lysis Buffer室温溶化，用无菌水5倍稀释使用。
（2）配制L/L检测液：L/L Buffer室温溶化后，作为稀释液将L/L substrate进行50倍稀释，配制成L/L检测液。
（3）ATP标准品的配制：用Lysis Buffer将ATP标准品进行10倍梯度稀释，制作10-12至10-17mol/μl浓度的ATP标准样品。
2.2 ATP标准曲线
（1）取10-12至10-17mol/μl浓度的ATP标准样品各10μl，分别加入50μl的L/L检测液，混合后放入发光检测仪检测（发光强度RLU）。
（2）根据ATP标准品与相应发光强度制作ATP-RLU标准曲线。
2.3 活性污泥样品检测
（1）抽取一定量的活性污泥，并混合为均匀悬液。
（2）取10μl活性污泥悬液，加入50μl Lysis Buffer，混合均匀，静置5分钟；然后加入50μl L/L检测液，并混合均匀，放入检测仪检测，获得总ATP发光强度。
（3）取10μl活性污泥悬液，加入50μl 纯水，混合均匀，静置5分钟；然后加入50μl L/L检测液，并混合均匀，放入检测仪检测，可获得水中游离ATP发光强度。（通常游离ATP占总ATP的比例小于1%）
（4）将样品发光强度带入标准曲线方程，获得样品中ATP含量。
（5）通过检测不同处理后的活性污泥或不同来源的活性污泥，可获得活性污泥的活性变化。
参考文献：
- 无
*如果您在实验中遇到任何问题, 请与我们的技术人员沟通, 我们将提供帮助.
联系电话: 010-5158 2336转803 电子邮箱: help
yph-bio.com
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